D'origine britannique, Rhona Mitra a suivi des cours de théâtre dans une école fondée par Judi Dench avant de se lancer dans une carrière d'actrice dans les années 1990. Elle se fait d'abord connaître auprès du public en tant que mannequin lorsqu'elle est choisie en 1997 pour incarner le personnage virtuel Lara Croft pour la promotion du jeu vidéo Tomb Raider. Pressentie pour jouer le rôle dans un premier projet de film au cinéma, elle est finalement évincée du projet (reprit en 2001 avec Angelina Jolie) après s'être brouillée avec l'éditeur du jeu vidéo.
Rhona Mitra a ensuite poursuivi sa carrière aux Etats-Unis. Elle est apparue au cinéma dans de nombreux films : dans Beowulf (aux côtés de Christophe Lambert), Hollow Man, Get Carter (avec Sylvester Stallone), La Vie de David Gale (avec Kevin Spacey et Kate Winslet) ou encore Le Nombre 23 (avec Jim Carrey). Elle tient des premiers rôles dans des films fantastiques où elle joue les héroïnes musclées, notamment dans Doomsday et le troisième volet de la saga des Underworld. A côté de cela, elle tourne dans des films plus intimistes comme le thriller Stolen ou la comédie romantique Separation City.
Parallèlement à sa carrière cinématographique, Rhona est apparue dans de nombreuses séries télévisées : dans la dernière saison de La Vie à cinq en 1999, puis dans la série médicale Gideon's Crossing en 2000. En 2003, elle interprète l'avocate Tara Wilson dans la série judiciaire The Practice, qu'elle jouera ensuite dans les deux premières saisons de la série qui en est dérivée, Boston Justice. En 2005, elle est l'une des guest stars de la saison 3 de Nip/Tuck, interprétant une inspecteur de police aussi sensuelle que détraquée. La comédienne renoue ensuite avec ce qui semble être son genre de prédilection, à savoir le fantastique et la science-fiction, puisqu'elle incarne le commandant Kiva dans la première saison de Stargate Universe (2009-2010), avant de tenir l'un des rôles principaux de The Gates (2010), mettant en scène les habitants très spéciaux d'une petite banlieue américaine. Elle incarne par la suite le major Rachel Dalton dans les saisons 3 et 4 de la série "Strike Back". En 2014, elle fait partie de la distribution principale de la série "The Last Ship".